Thursday, April 25th 2019                           

EBSI TEAM

Elucidation of Biosynthesis by isotopic spectrometry

 

Métabolisme

Connaissance des effets isotopiques issus des réactions du métabolisme central :
  • fractionnements isotopiques au cours des réactions post-photosynthétiques,
  • réactions de dégradation de molécules organiques,
  • lien entre le profil métabolomique et le profil isotopique : notion d'isotopomique. Application dans le domaine de la santé et de la nutrition

 

Etude isotopomique du métabolisme des cellules tumorales (domaine métabolisme)

Le fractionnement isotopique en 13C et en 15N dans des cellules tumorales opéré par les différentes voix métaboliques est à l'origine de la composition isotopique de la matière organique constituant les cellules et les tumeurs.

L'équipe EBSI a développé un procédé simple, rapide (10 min), peu coûteux (10 € par échantillon), sensible (˜1 mg de tissu sec), universel (toutes sortes d'échantillons biologiques) et innovant qui permet de différencier plusieurs types de tumeurs cancéreuses dans un modèle de cancer du sein.

Ce procédé a consisté à déterminer une « empreinte isotopique » pour chaque type de tumeur par irm-EA/MS . Globalement, la technique décrite dans le brevet est basée sur la distinction des cellules cancéreuses des cellules saines par une différence significative du couple des compositions isotopiques naturelles { δ13C; δ15N}. Afin que ces « biomarqueurs isotopiques » puissent être utilisés couramment, il est nécessaire qu'un certain nombre de critères d'ordre biologique et statistique soient vérifiés. Les résultats montrent que la teneur en 13C dans les tissus cancéreux est supérieure à celle des tissus ‘sains'. Il semble qu'il y ait un lien entre l'expression des Récepteurs Hormonaux (RH) et les teneurs isotopiques en 15N qui semblent appauvries dans les tissus et cellules qui n'expriment pas les RH. La teneur en 13C est corrélée aux teneurs en lipides tandis que la teneur en 15N est liée à l'ADN, à la teneur en protéine et en métabolites. La combinaison des données isotopiques et métabolomiques ( approche isotopomique ) par RMN1D &2D, par GC-MS et ainsi que des approches Q-PCR ont permis de mettre en évidence une voie métabolique mise en jeu dans la pathologie et ayant provoqué l'effet isotopique. Ces r é sultats sont en cours de validation sur un plus grand nombre d' é chantillons de tissus et de cellules de cancer exprimant des r é cepteurs, et en g é n é rant un plus grand nombre de donn é es isotopiques et quantitatives par le d é veloppement des approches isotopomiques. Cette approche multidisciplinaire qui met en jeu la chimie analytique par le d é veloppement de m é thode isotopique et la biologie du cancer permettra de comprendre au-delà de la preuve de concept technologique, les causes du fractionnement isotopique en situation pathologique .

Illa Tea, coordinatrice du projet, a obtenu une délégation CNRS, qu'elle a effectuée durant l'année universitaire 2014-2015 à l'ANU (Australian National University) pour renforcer ce projet au sein d'une collaboration internationale, indispensable pour aborder ce type de problématique.

 

Application de l'irm- 13C RMN pour l'étude de voies métaboliques (domaine métabolisme)

Les récentes avancées dans la sensibilité de l'irm-13C NMR ont permis de développer des approches originales pour l'étude du fractionnement isotopique engendré au cours des voies de biosynthèse des biomolécules. On peut citer deux exemples remarquables :

1. En métabolisme, le glucose est la molécule précurseur de la vaste majorité de bio-produits. De connaitre son fractionnement isotopique nous apporte de renseignements fondamentaux pour l'interprétation d'une large gamme des études « isotopomique » et « filiation ». Au cours de la biotransformation anaérobique du glucose en éthanol et en acide lactique , les micro-organismes Saccharomyces cerevisiae, Zymomonas mobilis and Leuconostoc mesenteroides exploitent trois voies métaboliques distinctes, respectivement l'Embden-Meyerhof-Parnas, l'Entner-Doudoroff et la phosphocétolase. Par conséquent, la filiation entre les positions carbones du glucose et ceux des produits accumulés est propre à chaque voie exploitée. Grâce à une méthodologie juste et précise, nous avons pu déterminer le fractionnement pour chaque position de l'éthanol (méthyle et méthylénique) et ainsi mis en évidence la présence d'effets isotopiques intramoléculaires uniques associés à chaque voie , bien que relativement faibles. Pour le groupe méthyle, un fractionnement n'est observé que pour la voie de phosphocétolase. Par contre, le groupe méthylène montre des fractionnements significatifs. Ces observations peuvent être reliées aux effets isotopiques connus pour quelques enzymes propres à chaque voie, et permettent une prédiction des étapes principales participant au fractionnement observé. (Travaux de thèse de Kevin BAYLE).

2. Le Tramadol est un antalgique commercial, agoniste des récepteurs morphiniques. Celui-ci a été récemment trouvé dans la nature, et possède un squelette carboné d'origine biosynthétique inconnue . Par une approche très originale, nous avons fait une ‘retro-biosynthèse' basée sur les teneurs position-spécifiques en 13C , déterminées par l'irm-13C RMN. Une grande variabilité est observée, avec des valeurs en d13Ci entre -11 et -53‰. Cette répartition non-statistique a été interprétée en lien avec les effets isotopiques cinétiques connus pour des enzymes et réactions impliquées dans la voie proposée. Ainsi, la recherche de confirmation d'une voie de biosynthèse s'est focalisée sur un nombre de choix contraint. (Travaux de thèse de Katarzyna ROMEK).