Mercredi 20 Septembre 2017                           

EQUIPE EBSI

Elucidation de Biosynthèse par Spectrométries Isotopiques

 

Développements méthodologiques

 

L'utilisation de la RMN pour les études isotopiques n'est possible que si la précision des mesures est de l'ordre de quelques unités pour mille. Or, la quantification très précise est un problème peu traité dans le monde de la RMN. La méthode la plus souvent utilisée pour atteindre cet objectif est d'utiliser la technique d'acquisition la plus simple possible. Bien que cette approche soit généralement satisfaisante en termes de précision, de nombreux problèmes méthodologiques demeurent. Par ailleurs, des méthodes plus sophistiquées d'acquisition ou de traitement du signal permettent une augmentation du rapport signal/bruit ou une meilleure séparation des signaux. Leur robustesse n'est toutefois pas toujours suffisante pour qu'elles donnent la précision souhaitée. L'objectif de cet axe est d'analyser l'influence des conditions d'acquisition (relaxation, milieu, séquence, référence) et de traitement du signal sur la quantification, et de proposer des solutions optimales en termes de sensibilité, de sélectivité et de fiabilité.

Cet axe comprend deux projets :

    La RMN 2D rapide et ultrarapide : développements méthodologiques et applications quantitatives
    La RMN 13C quantitative de haute précision

La RMN 2D rapide et ultrarapide : développements méthodologiques et applications quantitatives

 

Personnel Permanent: Patrick Giraudeau (porteur de projet), Serge Akoka, Benoît Charrier, Estelle Martineau
Doctorants: Laetitia Rouger (2014-17), Boris Gouilleux (2014-17), Tangi Jézéquel (2015-18), Jérémy Marchand (2015-2018)
Anciens doctorants: Adrien Le Guennec (2012-15), Meerakhan Pathan (2011-13), Estelle Martineau (2008-11)


Description générale

La mesure précise des concentrations d'analytes dans des échantillons chimiques ou biochimiques est, avec l'identification de ces analytes, l'un des objectifs majeurs de la chimie analytique. La résonance magnétique nucléaire (RMN) est largement utilisée dans un but quantitatif. Toutefois, la RMN 1D du proton souffre d'importants recouvrements entre les pics qui limitent son utilisation à des fins quantitatives, en particulier dans le cas de mélanges biologiques complexes. Afin de dépasser les limites actuelles de la RMN quantitative, nous développons de nouvelles approches quantitatives par RMN 2D , la RMN multidimensionnelle offrant une meilleure discrimination des résonances dans les milieux complexes. Toutefois, les expériences de RMN 2D conventionnelle sont affectées par de longues durées d'expérience qui, au-delà des contraintes d'occupation des spectromètres, limitent leur utilisation à des fins quantitatives (les expériences longues sont plus sensibles aux instabilités de l'appareillage) ou pour l'étude de processus se déroulant sur une courte échelle de temps (études cinétiques ou dynamiques). Nos travaux se concentrent donc sur le développement d'expériences de RMN 2D rapides et précises que nous appliquons à une large gamme d'études quantitatives.

 

RMN 2D quantitative rapide

Une première approche consiste en une optimisation soignée des expériences de RMN 2D conventionnelle à des fins quantitatives.

 

Les séquences d'impulsions, ainsi que les paramètres d'acquisition et de traitement, sont soigneusement optimisées afin d'obtenir des résultats précis en une durée minimale. Ainsi, nous avons réduit à quelques minutes la durée de plusieurs expériences de RMN 2D ( J - résolue, COSY-DQF, INADEQUATE 1H, etc.) tout en améliorant significativement leur précision. Ces méthodes permettent la mesure des concentrations absolues lorsqu'une procédure de calibration préalable est réalisée, ce qui est maintenant possible en un temps raisonnable. Dans le cadre de la thèse d'Estelle Martineau (2008-2011), ces méthodes ont été appliquées avec succès à la discrimination métabolique de cellules de culture de cancer du sein.

Cette thématique est actuellement poursuivie au travers de plusieurs projets et collaborations. Très récemment, nous avons atteint une précision de l'ordre du pour mille, ouvrant ainsi la voie à l'application de ces méthodes à l'analyse isotopique en abondance naturelle.

Processus d'analyse quantitative de mélanges complexes par RMN multi-dimensionnelle.
Photo © U. Salvagnin, copyright-free picture downloaded from this link .

 

RMN 2D ultrarapide et méthodes hybrides

 

 

Au cours des vingt dernières années, les spectroscopistes RMN ont développé de nombreuses approches afin de réduire la durée des expériences de RMN multi-dimensionnelle. La plus impressionante et la plus efficace est probablement la RMN 2D ultrarapide, récemment proposée par L. Frydman et ses collaborateurs. Cette méthodologie permet l'obtention d'un spectre 2D en un seul scan, et donc en une fraction de seconde.

En 2007, nous avons implémenté avec succès cette méthodologie sur les spectromètres du laboratoire CEISAM. Au cours des 8 dernières années, grâce à des développements méthodologiques novateurs, nous avons considérablement amélioré ses performances analytiques, en termes de résolution, de sensibilité, de forme de raie et de largeur spectrale. Nous avons également développé un ensemble d'outils permettant de rendre la RMN ultrarapide accessible aux non-spécialistes.

Depuis 2009, nous développons un ensemble de méthodes hybrides basées sur la RMN 2D ultrarapide, capables d'atteindre une précision de l'ordre de 1% en une durée réduite (d'une fraction de seconde à quelques minutes selon les échantillons).

Grâce aux développements réalisés, nous avons pu appliquer les méthodes développées à une large gamme de problématiques telles que (liste non exhaustive) :

  • l'analyse métabolomique ciblée et non-ciblée d'échantillons biologiques
  • la mesure d'enrichissements isotopiques spécifiques en fluxomique
  • l'étude en temps réel de mécanismes réactionnels
  • le suivi in situ de réactions électrochimiques

Ces travaux ont notamment été financés par l'ANR QUANTUM (2011-2014). De nouveaux développements méthodologiques et applications sont actuellement en cours, dans le cadre de projets financés par l'IUF, la région Pays de Loire (Pari Scientifique RésoNantes 2014-2017), et par nos partenaires industriels.

Quantitative Ultrafast 2D NMR COSY spectrum of a 50 mM metabolic mixture, recorded in 0.2 s on our 500 MHz spectrometer with a cryoprobe. Thanks to the methodological improvements we brought to the ultrafast methodology, the spectrum provides the same information as its conventional 2D NMR counterpart.

Les programmes d'acquisition et de traitement que nous développons pour la RMN 2D ultrarapide peuvent être obtenus en cliquant ici .

 

Collaborations

 

  Publications récentes

 Une liste actualisée de nos publications est disponible ici .

RMN 13C quantitative de haute précision

Contexte général

Les mesures RMN des teneurs en carbone 13 de l'ordre de l'abondance naturelle sont essentielles pour de nombreuses applications. Pour cela, une très grande précision de l'ordre de 1 pour-mille est nécessaire en raison d'une gamme étroite de déviations isotopiques spécifiques (moins de 40 pour-mille en 13C alors qu'elle est par exemple de 500 pour-mille en 2H).

Bien que le carbone 13 soit 70 fois plus abondant que le deutérium, la détermination par RMN des rapports isotopiques du carbone avec une grande précision est particulièrement difficile pour plusieurs raisons. Les valeurs importantes des temps de relaxation entraînent des temps d'expérience longs, ce qui augmente le risque d'imprécision. L'effet Overhauser doit être réduit au minimum par l'utilisation d'une période d'échantillonnage du signal courte et d'un découplage en créneaux inverses. De plus, la précision et la justesse des mesures sur le spectre 13C sont très dépendantes de l'efficacité du découplage large bande proton.

Grâce aux développements méthodologique que nous effectuons, EBSI a été la première équipe (et est encore l'une des rares) à obtenir la précision nécessaire pour pouvoir mesurer des abondances naturelles spécifiques en RMN-13C.

 

Découplage 1H

Parmi les difficultés mentionnée plus haut, l'efficacité du découplage large bande proton a été le dernier verrou à faire sauter.

Pour une mesure des teneurs isotopiques 13C , le point le plus important n'est pas la taille de la gamme efficace de découplage mais plutôt l'homogénéité à l'intérieur de cette gamme. Nos résultats démontrent que les méthodes utilisant des impulsions composites, comme WALTZ-16, ne permettent pas une quantification avec une précision de l'ordre de quelques pour-mille. Seules les impulsions adiabatiques ont des performances suffisantes pour atteindre cet objectif. Et même dans ce cas, il est indispensable d'optimiser la forme et la durée de l'impulsion ainsi que le cycle de phase.

  Poster: Optimization of adiabatic decoupling for Accurate Quantitative 13C-NMR at Natural Abundance

Nous avons développé une nouvelle impulsion adiabatique de découplage dont l'enveloppe est de forme cosinus et dont le balayage en fréquence (g(t) ) est calculé numériquement à partir de l'évolution de ω1 (f(t)) afin d'obtenir une adiabaticité on-résonance indépendante de l'offset.

 

Avec ce nouveau découplage adiabatique, les distorsions introduites par le découplage proton sont inférieures à 4 pour-mille et cela indépendamment de la présence de couplages homonucléaires.


La méthode développée permet de réduire les distorsions en fonction la fréquence de résonance à 4 pour-mille (à gauche) alors qu'elles sont supérieures à 60 pour-mille avec la méthode de référence (à droite).

L'analyse isotopique par RMN- 13C d'échantillons de vanilline et d'éthanol a été utilisée pour la validation de nos protocoles.

 

Réduction du temps de mesure sans perte de précision

Afin de réduire le temps d'acquisition tout en gardant une très grande précision, l'impact des imperfections RF sur le signal détecté a été caractérisé pour trois techniques de transfert d'aimantation (DEPT, INEPT et HCP). Seules les séquences DEPT et INEPT ont permis, grâce à l'incorporation d'impulsions adiabatiques adaptées, d'obtenir la justesse et la précision nécessaire à la RMN isotopique 13C . Par la suite, les mesures de reproductibilité interne ont conduit à écarter la séquence DEPT.

 


Influence des imperfections RF 13C et 1H sur la précision d'une mesure INEPT sur l'éthanol.
sequence standard ; séquence adiabatique .
 En fonction de l'offset 13C (à gauche) et de l'offset 1H (à droite).

  Poster: Adiabatic Pulse Sequences for high precision - Quantitative Isotopic 13C-NMR

 

L'évaluation de cette stratégie pour l'authentification des procédés de fabrication de principes actifs a été réalisée sur l'ibuprofène. Les résultats obtenus montrent que cette stratégie peut être efficacement utilisée pour déterminer la distribution 13C au sein d'une molécule donnée et pour comparer avec précision les variations dans la distribution isotopique entre différents échantillons de cette molécule. De plus, cette mesure peut être faite dans un temps très court pour ce type de molécules .

Le "pedigree" du principe actif ( une partie de son arbre généalogique ) peut être établi à partir du profil isotopique. Il pourra être utilisé pour caractériser ( i) un lot de production , (ii) un procédé de fabrication spécifique ou (iii) l' origine des matières premières utilisées dans le processus.

Ecart à la valeur moyenne des teneurs en 13C mesurées avec l'INEPT pour les sites 4 à 10 sur différents échantillons d'ibuprofène: :  Abbott-Belgique, : Abbott-Portugal, : France

  Poster: Isotopic finger-printing of Active Pharmaceutical Ingredients by 13C NMR and polarization transfer techniques as a tool to fight against counterfeiting

La même approche a été appliquée à l'authentification d'huiles végétales. A l'aide d'un spectre INEPT 13C acquis dans des conditions rigoureuses, nous obtenons simultanément des informations sur la teneur isotopique de certains carbones et un profile métabolique complet de l'échantillon. Cette analyse « isotopomique » permet de discriminer des huiles végétales en fonction de leur origine botanique ou géographique.

 
Référence isotopique 13C

Jusqu'à présent, la mesure par RMN des déviations isotopiques spécifiques 13C utilise la teneur globale 13C mesurée par spectrométrie de masse de rapport isotopique (SMRI) ; la RMN ne permettant qu'une mesure des fractions molaires des différents isotopomères.

L'utilisation d'une référence d'abondance isotopique connue permet de contourner ce problème et d'obtenir directement les déviations isotopiques spécifiques à partir du spectre RMN- 13C. Toutefois, cela suppose de connaitre le rapport des concentrations entre la référence et le produit mesuré, et cela avec une précision de l'ordre du pour-mille. La détermination de ce rapport par des méthodes gravimétriques est alors impossible car elle implique la connaissance des puretés massiques avec une grande précision (cela est envisageable pour la référence, mais pas pour le produit mesuré).

En revanche, un spectre RMN- 1H permet de mesurer le rapport des concentrations avec une grande précision. Mais pour être applicable en routine, la mesure RMN- 1H doit être faite sur le même tube que la mesure RMN- 13C et le spectre proton est alors très largement déformé par le phénomène de Radiation Damping (RD). Nous avons donc développé une méthode originale de suppression du RD. Cette technique, appelée DWET, repose sur la suppression d'une large part du signal par sélection spatiale.

L'ensemble de cette stratégie permet donc pour la première fois de déterminer, entièrement par RMN, les déviations isotopiques spécifiques (sans SMRI).

 

Poster : First steps in the design of an internal reference for 13C intramolecular composition measured by NMR spectrometry.

 

Collaborations  :

Société Eurofins, Nantes

CDP Innovation, Lyon

JRC, Ispra, Italie

Université Saint-Joseph, Beyrouth, Liban

 

Sélections de publications

Découplage adiabatique

  • E. Tenailleau, S. Akoka. Adiabatic 1H decoupling scheme for very accurate intensity measurements in 13C-NMR. Journal of Magnetic Resonance, 2007, 185, 50-58.

Mesure des teneurs Isotopiques 13C par RMN

  • E. Caytan, E.P. Botosoa, V. Silvestre, R.J. Robins, S. Akoka, G.S. Remaud. Accurate Quantitative 13C NMR Spectroscopy: Repeatability over Time of Site-Specific 13C Isotope Ratio Determination. Analytical Chemistry, 2007, 79, 8266-8269.
  • F.Thomas, C. Randet, A. Gilbert, V. Silvestre, E. Jamin, S. Akoka, G. Remaud, N. S egebarth, C. Guillou. Improved Characterization of the Botanical Origin of Sugar by Carbon-13 SNIF-NMR applied to Ethanol. Journal of Agricultural Food Chemistry, 2010, 58, 11580-11585.
  • A. Gilbert, V. Silvestre, N. Segebarth, G. Tcherkez, C. Guillou, R. Robins, S. Akoka, G. Remaud. The intramolecular 13C-distribution in ethanol reveals the influence of the CO 2 -fixation pathway and environmental conditions on the site-specific 13C variation in glucose. Plant, Cell & Environment, 2011, 34, 1104-1112.

Mesure des teneurs isotopiques 13C par transfer d'aimantation

  • C. Thibaudeau, G. Remaud, V. Silvestre, S. Akoka. Performance Evaluation of Quantitative Adiabatic 13C NMR Pulse Sequences for Site-specific Isotopic Measurements. Analytical Chemistry, 2010 , 82 (13), 5582–5590 .
  • U. Bussy, C. Thibaudeau, F. Thomas, J.-R. Desmurs, E. Jamin, G. S. Remaud, V. Silvestre, S. Akoka. Isotopic finger-printing of Active Pharmaceutical Ingredients by 13C NMR and polarization transfer techniques as a tool to fight against counterfeiting. Talanta, 2011, 85, 1909-1914.
  • N. Merchak, J. Bejjani, T. Rizk, V . Silvestre, G.S. Remaud, S. Akoka. 13 C isotopomics of triacylglycerols using NMR with polarization transfer techniques. Analytical Methods, 2015, 7(12) 4889-1891.

Référence isotopique

  • K. Bayle, M. Julien, G. S. Remaud, S. Akoka. Suppression of radiation damping for high precision quantitative NMR. Journal of Magnetic Resonance, 2015, 259, 121-125 .
  • K. Bayle, M. Grand, A. Chaintreau, R. J. Robins, W. Fieber, H. Sommer, S. Akoka, G. S. Remaud. Internal Referencing for 13 C Position-Specific Isotope Analysis Measured by NMR Spectrometry. Analytical Chemistry, 2015, 87(15), 7550-7554 .